免疫组化辅助试剂包(SP法)

使用说明书

仅供体外研究使用,不用于临床诊断!

第1版(2016年04月修订)

[产品信息]

通过生物素标记的二抗(抗抗体)与结合在组织切片上的一抗特异性结合形成免疫复合物,为进一步提高信号的强度,借助生物素和链霉亲和素信号放大系统,生物素会和辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素结合,形成更为复杂的聚合物。位于聚合物上HRP会催化底物H2O2与DAB反应,最终形成棕褐色不溶性色原,特异性的将免疫原在组织和细胞中标定出来,通过显微镜观察确定免疫原的最终位点。

[试剂组分]

编号

成分

                      包装规格

1

内源性过氧化物酶阻断剂工作液

3mL

6mL

18mL

55mL

110mL

2

生物素标记抗IgG聚合物(可选)

3mL6mL18mL55mL110mL

3

HRP标记的链霉亲和素工作液

3mL6mL18mL55mL110mL

4

封闭血清工作液

3mL6mL18mL55mL110mL

5

苏木素染液

3mL6mL18mL55mL110mL

6

枸橼酸钠抗原修复液

10mL

20mL

60mL

200mL

400mL

7

显色剂 (1×)

3mL

6mL

18mL

55mL

110mL

8

DAB显色液 (50×)

60uL

120uL

360uL

1.1mL

2.2mL

[备选指标]

编号

名称

编号

名称

IS085-2-1

生物素标记兔抗人IgG聚合物

IS085-2-9

生物素标记兔抗犬IgG聚合物

IS085-2-2

生物素标记兔抗小鼠IgG聚合物

IS085-2-10

生物素标记兔抗绵羊IgG聚合物

IS085-2-3

生物素标记兔抗大鼠IgG聚合物

IS085-2-11

生物素标记兔抗猫IgG聚合物

IS085-2-4

生物素标记兔抗猪IgG聚合物

IS085-2-12

生物素标记兔抗马IgG聚合物

IS085-2-5

生物素标记兔抗鸡IgG聚合物

IS085-2-13

生物素标记山羊抗兔IgG聚合物

IS085-2-6

生物素标记兔抗牛IgG聚合物

IS085-2-14

生物素标记山羊抗小鼠IgG聚合物

IS085-2-7

生物素标记兔抗山羊IgG聚合物

IS085-2-15

生物素标记豚鼠抗兔IgG聚合物

IS085-2-8

生物素标记兔抗豚鼠IgG聚合物



[适用范围]

本产品仅用于免疫组化实验,适用于手工和机器大批量操作。本试剂仅对10%中性缓冲福尔马林固定石蜡包埋的组织进行了验证,不作其他用途。

[储存及有效期]

2~8℃避光保存,不得冻存;产品有效期为6个月。

[实验操作]

1、完成IHC实验还要的设备和试剂

   a)、移液器、恒温箱、修复仪、免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶。

   b)、DAB显色液:利用显色剂稀释DAB显色液到工作液浓度,现配现用。

   c)、pH 6.0,0.01M枸橼酸钠抗原修复液:利用双蒸水稀释到工作液浓度使用。

1、实验步骤

(1)烘片:铅笔标记用于区分石蜡切片,65℃,1-2h。

(2)脱蜡至水:烘片结束,石蜡切片依次于二甲苯I 30min,二甲苯II 30min,100%、100%、95%、80%、70%的乙醇中各10min,再放入纯水里10min。

(3)抗原修复。高温高压法和微波法自选。

      高温高压法:压力锅中加入pH 6.0 ,0.01M枸橼酸钠抗原修复液约1000ml,切片插入塑料架上,放入压力锅,盖上锅盖(此时不扣上压力阀)1600W预热至沸腾,扣上压力阀1300W,待高压锅阀门喷气开始计时,修复时间为2分钟。

      微波法:取一定量pH 6.0 ,0.01M枸橼酸钠抗原修复液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,微波低火处理3分钟,放置8分钟后低火3分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS冲洗3分钟×3次。

(4)阻断内源性过氧化物酶。加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂,室温孵育10分钟;PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

(5)非特异性位点的封闭:甩去残夜,滴加封闭血清工作液覆盖切片,约200ul/片,室温孵育20min。

(6)滴加一抗。根据组织大小,滴加适量的一抗,37℃孵育60分钟;PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

(7)根据实验物种的差异选择合适的生物素标记抗IgG聚合物,滴加100μL或适量的生物素标记抗IgG聚合物,37℃孵育30分钟;PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

(8)滴加辣根酶标记链霉亲和素工作液。滴加100uL或适量的辣根酶标记链霉亲和素工作液,37℃孵育30分钟;PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

(9)显色。加入适量新鲜配制的DAB,室温孵育5秒-5分钟,根据显微镜下着色情况终止反应。

(10)复染。自来水冲洗,苏木素染色液孵育2分钟;滴加1%盐酸酒精分色1秒、PBS冲洗返蓝。

(11)脱水、透明、封片

(12)显微镜观察,拍照。

[注意事项]

1、在每一次染色过程中,必须有空白对照和阴性对照实验同时进行。

2、如果阳性组织对照不能显示适当的阳性染色,应判定该批次样本的检测结果无效。

3、若生物素标记IgG聚合物孵育温度过高或孵育时间过长,可能导致染色过强及背景染色。

4、红细胞和细胞色素 C可能会造成假阳性结果。

5、脱蜡不彻底,容易影响染色效果,建议免疫组化切片脱蜡与常规HE脱蜡分开。

6、为防止可能出现的假阳性、假阴性结果,在实验过程中需设置阳性与阴性对照。

7、实验中滴加试剂时,过多的PBS缓冲液会导致试剂被稀释,将引起染色强度变弱,因此,滴加试剂前应除去多余的缓冲液。

8、在实验操作过程中,请穿戴好手套、眼镜和实验服,以及依照相应的实验流程,做好防护措施。


  • IHC Support Pack (SP Method)
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