一氧化氮测定试剂盒 (A012)
使用说明书
仅供体外研究使用，不用于临床诊断!
第1版（2016年04月修订）
[预期应用]
本试剂盒运用硝酸还原法定量测定血清、胃液、尿液、细胞培养上清或其它相关生物液体中一氧化氮（NO）含量。
[试剂盒内容]
| 试剂名称 | 数量（50/25T） | 试剂名称 | 数量（50/25T） |
Reagent 1 | 2×6ml/1×6ml | Reagent 6 | 1/1 |
Reagent 2 | 2×6ml/1×6ml | Reagent 7 | 1×8mL//1×4ml |
Reagent 3 | 1×12ml//1×6ml | Standard(10mmol/L | 1×0.5ml/1×0.5ml |
Reagent 4 | 1×6ml//1×3ml | Attachment | 2×40ml/1×40ml |
Reagent 5 | 1/1 | Instruction manual | 1/1 |
Note：Attachment 是双蒸水.
[需自备的设备及试剂]
1、分光光度计（比色测定波长为550nm），0.5厘米光路玻璃试管
2、恒温水浴箱或恒温箱（孵育温度：37℃和90～100℃）
3、台式离心机
4、微量移液器及吸头
5、漩涡混合仪 ，玻璃棒
6、蒸馏水或去离子水
[试剂盒的储存及有效期]
1、试剂1：-20℃或低于-20℃可保存3个月。使用前将试剂置于37℃或室温下充分溶解。
2、试剂2：-20℃或低于-20℃可保存3个月。使用前将试剂置于37℃或室温下充分溶解。
3、试剂3：室温保存6个月。
4、试剂4：室温保存6个月。
5、试剂5：避光保存。
6、试剂6：避光冷藏保存。如果颜色变成深褐色，则不能使用。
7、试剂7：室温保存6个月。
8、10mmol/L标准：-20℃或低于-20℃可保存6个月。
[试剂准备]
1、混合试剂制备：混合试剂1和试剂2的比例为1:1，根据实验需求量配置。完全混合后，需在24小时内使用。
2、试剂5：粉末×1瓶，使用时，加入20ml（50T）或10ml×（25T）90OC~100℃热蒸馏水完全溶解后，避光储存。试剂5为过饱和溶液，最好加入23ml（50T）/11.5ml（25T）热蒸馏水（考虑热膨胀），同时水浴加热，并用玻璃棒搅拌，使其完全溶解。配好的试剂5存放时可能会出现晶体，使用前请加热并搅拌，使其完全溶解。
3、试剂6：粉末×1瓶，使用时加入8ml（50T）或4ml（25T）双蒸馏水溶解。避光冷藏。如果颜色变成深褐色，请不要使用。
4。显色剂：根据实验需求量配置（配置好的显色剂，可在1个月内使用）。试剂5、试剂6和试剂7的混合比例为2.5:1:1。可存放在40ml干净的方形瓶中，避光。低温存放可能会出现晶体。再次使用时，100℃水浴加热，反复摇动使其完全溶解。
5。100μmol/L标准工作液配制：取0.1ml标准品，加入双蒸馏水，直至体积达到10ml（100倍稀释），充分混合，浓度为100μmol/L标准工作液。准备后需立即使用。
[标本处理]
1、液体样品（如血清、胃液、尿液、细胞培养上清和其他生物液体等）NO测定：
预处理：根据实验方法。
2、组织样品NO测定
预处理：根据实验方法。
[操作步骤]
1、液体样品NO测定
操作表：
空白 | 标准品 | 样本 | |
双蒸水 (ml | 0.1 | ||
100μmol/L 标准品工作液 (ml) | 0.1 | ||
液体样本 (ml) | 0.1 | ||
混合试剂 (ml) | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| 充分搅拌，在37℃水浴中孵育60分钟。 | |||
试剂 3 (ml) | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
试剂 4 (ml) | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 用漩涡混合仪充分搅拌30秒钟，放置40分钟，3500～4000转离心10分钟，取上清液进行显色反应。 | |||
上清 (ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 显色液(ml | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| 充分搅拌，放置10分钟，吸取反应液于比色皿（0.5cm)中，在550nm下测量OD值（用蒸馏水调零）。 | |||
说明：
a、如果在冬天完成试验，请在37℃预热所有试剂5分钟。
b、如果上清液不足，请延长离心时间或减少上清取样量（例如0.4ml或0.45ml），确保所有试管上样体积一致，试管中不要有沉淀物。
2、组织样品NO测定
操作表：
空白 | 标准品 | 样本 | |
双蒸水 (ml | 0.5 | 0.4 | |
100μmol/L 标准品工作液 (ml) | 0.1 | ||
匀浆 (ml) | 0.5 | ||
混合试剂 (ml) | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| 充分搅拌，在37℃水浴中孵育60分钟。 | |||
试剂 3 (ml) | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
试剂 4 (ml) | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 用漩涡混合仪充分搅拌30秒钟，放置40分钟，3500～4000转离心10分钟，取上清液进行显色反应。 | |||
上清 (ml) | 0.8 | 0.8 | 0.8 |
| 显色液(ml | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| 充分搅拌，放置10分钟，吸取反应液于比色皿（0.5cm)中，在550nm下测量OD值（用蒸馏水调零）。 | |||
说明：
a、如果在冬天完成试验，请在37℃预热所有试剂5分钟。
b、如果上清液不足，请延长离心时间或减少上清取样量（例如0.4ml或0.45ml），确保所有试管上样体积一致，试管中不要有沉淀物。
[实验原理]
NO化学性质非常活泼，易转化为硝酸盐（NO3-）和亚硝酸盐（NO2-），NO2-也可转化为NO3-。本试剂盒采用硝酸还原酶特异地将NO3-还原成NO2-，通过测定OD值计算NO含量。
[样本值]
1、推荐采样量：
牛血清：300μL
绵羊血清：300μL
大鼠和小鼠血清：100μL
兔血清：100μL
10%组织匀浆：500μl
细胞裂解液：500μL
细胞培养上清液：100μL
2、正常NO含量：
样本 | 样本量（仅供参考） | NO含量（仅供参考） |
大鼠血清 | 100μl | 38.0±23.4μmol/L |
小鼠血清 | 100μl | 49.96±23.76μmol/L |
兔血清 | 100μl | 99.16±39.5μmol/ |
狗血清 | 100μl | 89.51±32.13μmol/L |
[说明]
1、试剂1、试剂2和标准需避免反复冻融。如果要分次实验（＞3次），那么请将试剂1、试剂2和标准分装储存，根据每次实验的使用量分装及配置试剂。制备好的显色剂需避光。
2、样本不立即用于实验（如血清、血浆、组织等），可置于-70℃或低于-70℃保存。冻存样品可在半年内使用。
3、所有试剂配制和空白管需使用不含NO2-的双蒸水或三蒸水（试剂盒有双蒸馏水）。
4、完成反应和离心后，取上清时避免吸入沉积物，否则OD值会大幅度增高，严重干扰结果的有效性。
5、试管选择：
a、建议使用一次性塑料试管。
b、若要使用玻璃试管，请将其浸泡在洗涤剂溶液中超过半小时，煮沸0.5～1小时，小心刷洗，用自来水冲洗15～20次，弃水，用蒸馏水冲洗1～2次，烘干后使用。
